菜单导航

的克隆及不同叶色品种间的表达差异

作者: 龙猫 发布时间: 2021年11月11日 16:31:19

大量研究表明,植物的色泽发育和植物类黄酮代谢紧密有关。花色苷是广泛存在于被子植物中的一类重要的类黄酮化合物。它是植物花朵、叶片和果实中几乎所有色泽形成的物质基础(; )。植物中基本的花色苷有3种,即花葵素、花青素、花翠素,以及这些花色素的甲基化衍生物等()。二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)是花色素苷合成途径中后期表达的第1个关键酶,它以二氢黄酮醇类(DHK,DHQ,DHM)为底物,在辅因子NADPH的作用下将4位的羰基还原为羟基,产生上述3种无色原花色素()。DFR是1个短链还原酶,属于二氢黄酮醇-4-还原酶超家族()。采用转座子标签技术第1次从玉米(Zea mays)分离克隆出DFR基因,随后从金鱼草(Antirrhinum majus)()和矮牵牛(Petunia hybrida)()中克隆到了DFR基因。随着深入研究,人们发现DFR对于花色的改变具有重要的作用。将反义DFR基因导入蝴蝶草(Torenia concolor),发现转化株的花色素苷合成减少,黄酮和黄酮醇(此二者为助色素)含量显著提高,获得了开蓝色花的蝴蝶草,表明调控花色素苷的助色素含量是花色改变的途径之一; 还分别将正义的DFR和CHS转入蓝猪耳(Torenia fournier)中,转基因株系的花冠花色素苷含量均呈不同程度的减少。

苹果属(Malus)观赏海棠是苹果属植物中最具观赏价值的类型,树形优美,花色丰富多彩,其叶色有绿色叶类、新叶有色类和常色紫叶类,是园林景观中不可缺少的彩叶树种资源。然而,在这一多色型植物资源中,叶片色泽形成的遗传机制、DFR基因结构和功能及其品种间差异至今还未见报道。本文在克隆获得苹果属观赏海棠叶片查尔酮合成酶(McCHS)、查尔酮异构酶(McCHI)和黄烷酮3-羟化酶(McF3H)基因(GenBank登陆号分别为:FJ599763,FJ817485和FJ817486),并对不同叶色品种基因表达差异分析的基础上,拟从常色紫叶品种中克隆DFR基因,并对基因及其编码蛋白序列进行分析,采用实时荧光定量PCR技术检测不同叶色品种中DFR表达量,并与花色苷含量进行对比分析,为观赏海棠不同品种间叶色差异的分子机制研究提供理论基础与试验证据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

选取苹果属观赏海棠中具有典型叶色的4个品种叶片为试材,即:绿色叶类品种‘火焰’(M.‘Flame’)、新叶有色类(幼叶红色、功能叶为绿色)品种‘绚丽’(M.‘Radiant’)和‘高原之火’(M.‘Prairifire’)、常色紫叶类品种‘王族’(M.‘Royalty’)。2008年春季,在北京农学院海棠种质资源圃采集4个品种相同自然条件下4年生树体萌芽后7天的幼叶和萌芽后50天的功能叶,液氮速冻后-80 ℃保存备用。

1.2 总RNA的提取及cDNA第1链的合成

用改良热硼酸法()提取‘王族’幼叶总RNA。以提取的总RNA为模板,利用Clontech SMARTTM Library试剂盒(购自Clontech生物有限公司)合成3’-RACE和5’-RACE cDNA第1链。采用CTAB法提取‘王族’叶片总DNA()。

1.3 观赏海棠McDFR序列的克隆

以上述提取得到的‘王族’叶片cDNA为模板,根据GenBank上登录的近缘植物二氢黄酮醇-4 -还原酶基因保守区段序列,设计3’端引物DFRP1:CACATCCTCAGCAGGAACTG,扩增McDFR基因的3’端序列; 设计5 ’端引物DFRP2: GCTTGATGATGCCATAATGTG,DFRP3: CATTTCTTAAGATCGGCGAAAGTC,扩增McDFR基因的5 ’端序列。UPM通用引物由RACE试剂盒提供,根据试剂盒说明,转录产物的3’末端和5’末端分别用DFRP1和DFRP2及UPM引物扩增,其PCR反应条件为94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1 min,64 ℃和68 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环; 72 ℃延伸5 min。将第1轮PCR产物稀释1 000倍,取1 μL作为模板,以DFRP3和UPM为引物,进行巢式PCR反应,PCR反应条件与第1轮相同。经回收、纯化,与pMD19-TVector(购自宝生物工程有限公司)连接,转化DH5α感受态细胞,蓝白斑筛选后测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。用DNAMAN5.2.2软件拼接以上序列得到观赏海棠叶片二氢黄酮醇-4-还原酶基因全长cDNA序列。

1.4 观赏海棠McDFR基因cDNA和DNA全长序列的获得

以上述提取得到的‘王族’叶片cDNA和DNA为模板,设计全长引物DFRF: ATGGGATCCGAGTCCGAATC和DFRR: ACCTACTTTGACATCAACGAGG,扩增二氢黄酮醇-4-还原酶基因的全长序列。PCR反应条件: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性1min,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,30个循环; 72℃延伸5 min。PCR产物经回收、纯化,与pMD19-TVector(购自宝生物工程公司)连接,转化DH5α感受态细胞,蓝白斑筛选后测序(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.5 实时荧光定量PCR分析

分别提取‘绚丽’、‘火焰’、‘高原之火’、‘王族’4个品种的幼叶和功能叶RNA (),使用M-MuLV First cDNA Synthesis Kit(购自Promega公司)合成第1链cDNA备用。按照RealMaster Mix (SYBR Green) PCR试剂盒(购自天根生化科技有限公司)操作指南,采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)的方法,检测基因的相对表达量。扩增目标基因McDFR的引物设计为DFR-F: GGTTGGATGTACTTCGTCTC和DFR-R: TGATGAGGCTTGGTGGCAT,预测产物长度是145 bp,适用于荧光定量PCR; 以苹果属的杂交种(Malus × domestica) 18S ribosomal RNA基因(GenBank序列号: DQ341382)作为内参基因,其引物18SR-F: ACACGGGGAGGTAGTGACAA和18SRR: CCTCCAATGGATCCTCGTTA,预测产物长度是80 bp,适用于荧光定量PCR。