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《安徽农业大学》2019年硕士论文

作者: 龙猫 发布时间: 2021年11月11日 16:30:37

【摘要】:金鱼草是一种在研究植物叶序方面十分特殊的植物,其同一植株上有着不同的叶序形态,基部叶序以对生状态为主,中上部叶序主要为螺旋状互生。叶原基起源于植物顶端分生组织(SAM),因其在茎尖上的发生位置不同,从而决定了叶在茎上的排列(叶序)。MADS-box基因家族是一类十分重要的转录调控因子,对植物顶端分生组织(SAM)具有重要的影响。本研究以金鱼草品种“泛美夏粉”为试验材料,通过采用单酶切以及同源重组的方式构建了过量表达载体,并经农杆菌介导法成功将目的基因的过量表达载体转入拟南芥中,获得了多个株系,进行表型观察,并辅以生物信息学分析,从而探究MADS-box基因AmDEFH28的基因功能及对植物叶序的影响。1.试验根据课题组之前对金鱼草叶序转录组的数据分析,通过Blast软件搜索到目的基因AmDEFH28,设计引物,提取金鱼草总RNA后,经过RT-PCR方法克隆得到了目的基因AmDEFH28。并利用生物信息学对目的基因AmDEFH28进行分析,得到了全长759bp的CDS序列;目的基因AmDEFH28与PhFBP29相似度最高,相似度为85.77%;AmDEFH25基因所编码的蛋白质由252个氨基酸组成,分子式为C1271H2072N3840394S8,其不稳定指数为68.49,蛋白质性质较不稳定,亲水性-0.833,为亲水性蛋白质;不存在蛋白信号肽序列,没有剪切位点;共有5个潜在磷酸化位点;预测了目的基因的二级结构与三级结构。2.试验利用荧光定量PCR技术,对目的基因AmDEFH28在金鱼草中的相对表达量进行了分析,AmDEFH28基因在金鱼草生长周期内不同器官中都有表达,幼苗期基因表达量:根茎叶,成熟期基因表达量:叶茎花根。3.试验利用pCAMIBA1301载体质粒,通过单酶切以及同源重组的方式构建了AmDEFH28的过量表达载体,将载体转入大肠杆菌中,并经电导法导入GV1301农杆菌中,将AmDEFH28的过量表达载体通过花序浸染法转入拟南芥中,并利用卡那霉素、庆大霉素、利福平与潮霉素B等抗生素逐步进行筛选,最终获得纯合子转基因拟南芥植株。4.试验通过图像以及显微成像技术对转基因拟南芥进行表型观察,利用哥伦比亚型(Columbia-0)野生拟南芥作为对照组,发现转基因拟南芥生长缓慢,植株矮小,叶片增多,叶片形状变化、大小变大,分枝增加、花芽分化和花序轴抽出推迟,叶序出现对生,花器官发育改变的表型。5.试验目的基因从金鱼草叶序转录组中获得,后续表型观察发现其转基因拟南芥出现了对生表型,表明目的基因AmDEFH28对植物产生对生叶序有一定影响。